生物樣品具有含水量高、質(zhì)地柔軟、導(dǎo)電性差、容易變形等特點(diǎn)，因此采用掃描電鏡觀察生物樣品時(shí)，要對(duì)樣品進(jìn)行必要的處理。

SEM掃描電鏡生物樣品制備要求

①樣品要盡可能干燥，若樣品中含有水份，水分揮發(fā)會(huì)造成倉內(nèi)真空度急劇下降，導(dǎo)致圖像漂移，有白色條紋，甚至?xí)绊憻艚z壽命;

②熱穩(wěn)定性好，熱穩(wěn)定性差的樣品往往在電子束的轟擊下分解，釋放氣體和其他物質(zhì)，污染掃描電鏡;

③導(dǎo)電性好，導(dǎo)電性差的樣品會(huì)發(fā)生荷電效應(yīng)，造成圖像畸變，亮點(diǎn)亮線，像散等;

④不含強(qiáng)磁性，強(qiáng)磁性的樣品觀察一般會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的像散，無法消去，磁性粉末如果粘的不牢固還可能會(huì)吸附到探頭上，損害sem掃描電鏡。

掃描電鏡生物樣品通常指的是動(dòng)物的體液、肌肉、毛發(fā)和一些組織器官，植物的根、莖、葉、果實(shí)等，以及各類微生物(細(xì)菌、真菌等)。生物樣品的含水量高，一般為70%-80%，只有少數(shù)的樣品，如一些花粉、毛發(fā)等可以直接放入sem掃描電鏡中觀察，大部分生物樣品需要經(jīng)過脫水干燥處理后才能進(jìn)行觀察。

掃描電鏡生物樣品制備的關(guān)鍵步驟是干燥，應(yīng)盡量減少因水分蒸發(fā)導(dǎo)致的形變。大多數(shù)動(dòng)植物，特別是柔軟的細(xì)胞和組織，在干燥時(shí)由于體積應(yīng)力和表面張力的作用，容易發(fā)生明顯的塌陷和變形，造成形貌失真。

SEM掃描電鏡生物樣品制備方法

取材：

一般使用鋒利的刀片將樣品切成5mm見方，高度3mm左右，在滿足觀察條件的前提下，樣品小一些更好，一方面臨界點(diǎn)干燥儀的樣品倉較小，另一方面，小的樣品尺寸固定液更容易滲透到樣品內(nèi)部，固定效果更好。取材完成后，先進(jìn)行清洗(超聲清洗3-5min)，再迅速地放置到固定液中，放置樣品脫水皺縮。

固定：

臨界點(diǎn)干燥法前處理常用的固定劑有戊二醛和四氧化鋨。

戊二醛是一種五碳醛，一般配制濃度為1-4%，常用濃度為2.5%(PH7.2-7.4)。一般市場(chǎng)上所售賣的戊二醛濃度為25%，使用前需要對(duì)其稀釋。溫度較高或者堿性條件下，戊二醛容易發(fā)生聚合失去醛基，降低交聯(lián)能力，因此，一般使用0.1M的磷酸緩沖液作為溶劑稀釋戊二醛，并在4℃下保存。

特別注意，戊二醛對(duì)皮膚有硬化作用，皮膚粘上會(huì)變黃，難以洗掉，所以使用時(shí)一定要帶手套。

它的反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑。用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間固定(但Z好不要超過一個(gè)星期)，因而適用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室或野外現(xiàn)場(chǎng)取材。但戊二醛對(duì)于含脂類較多的樣品固定效果不佳，如細(xì)胞膜。

四氧化鋨是一種很強(qiáng)的氧化劑，一般配制濃度為0.5-2.0%，常用濃度為0.5-1.0%(PH7.2-7.4)。它具有很強(qiáng)的毒性，四氧 化鋨氣體對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激，對(duì)眼睛有嚴(yán)重的破壞作用，因此在使用時(shí)應(yīng)特別小心，盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且嚴(yán)格控制用量。但它作為固定劑擁有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：

①四氧化鋨可以與脂類、糖類和蛋白質(zhì)反應(yīng)。其對(duì)脂類的固定作用可以補(bǔ)充醛類固定劑對(duì)脂類固定不足的缺點(diǎn)。

②用四氧化鋨固定材料時(shí)，被還原的鋨能沉積在樣品表面上，能增加膜的反差，起到“電子染色”作用，往往細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)比較清晰。

因此，含脂類物質(zhì)比較少的生物樣品(如植物類)，采用戊二醛固定，將采取的樣品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超過4h即可。對(duì)于含脂類物質(zhì)較多的樣品(如細(xì)胞膜)，采用戊二醛和四氧 化鋨雙重固定，先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3h以上，再浸泡在1%的四氧化鋨1h。

漂洗：

用0.1M的磷酸緩沖液沖洗4次，每次20min，洗凈固定液。

脫水：

配置濃度分別為30%，50%，70%，90%，1**%的酒精，用不同濃度的酒精溶液逐級(jí)脫水，從低濃度到高濃度(30%2次，50%2次，70%1次，90%1次，BAI分百兩次)浸泡1-2次，每次10min。

置換：

將脫水后的樣品浸泡在醋酸異戊酯溶液中15min左右，醋酸異戊酯的JI性較低，臨界點(diǎn)干燥時(shí)，能夠更好地與二氧化碳置換，干燥效果更好。

干燥：

采用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥。此方法是根據(jù)物質(zhì)處在臨界點(diǎn)時(shí)的特殊物理狀態(tài)設(shè)計(jì)的一種干燥方法。在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面完全消失，液體的表面張力系數(shù)為零。簡(jiǎn)單來說就是，通過消除樣品表面張力、使得掃描電鏡樣品在不受表面張力損傷的條件下干燥。

經(jīng)過以上步驟，就能得到飽滿的不皺縮的sem掃描電鏡生物樣品了。